发布日期：2025-01-03 17:20 点击次数：71
肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，靶向治疗是肺癌的理想治疗手段。早期的肺部靶向制剂多是将药物包载于十几到几十微米的微球中，静脉注射后利用肺毛细血管床对粒径大于7 μm的微粒的机械截留作用将药物靶向至肺部[1]。然而，微球粒径超过毛细血管径，静脉注射可能堵塞血管，带来隐患。因此，有必要寻求一种新的肺靶向给药系统。
诸多研究[2, 3, 4, 5]证实，干粉吸入剂能有效地将药物输送至肺部，获得较高的肺部药物浓度，降低药物在其他器官的分布，减轻或避免药物的不良反应，已被用于慢性阻塞性肺病、肺结核、肺炎等肺部疾病的治疗。近年来，采用生物降解材料制备的微粒载药系统被广泛用于干粉吸入给药[6, 7]。在各种高分子聚合载体材料中，壳聚糖微球具有的独特的物理化学和生物学性质，使其尤其适用于肺部给药系统[8, 9, 10]：（1）壳聚糖与呼吸道和肺泡上皮细胞的生物相容性好，且具有良好的生物降解性；（2）壳聚糖带正电荷，能与肺泡黏膜的负电荷相互作用，提高黏附性，降低清除率，延长肺部滞留时间；（3）具有溶胀性，微球在湿润的肺部沉积后即可吸水溶胀，体积径增大，避免巨噬细胞的吞噬。
肺泡表面成分的70%～85%为磷脂类物质，以磷脂为主要材料的载体在肺部给药中具有生物相容性好、易吸收等独特优势。磷脂复合物是药物与磷脂按1∶1或1∶2的比例，以共价键结合而成的一种药物载体，能促进药物从亲水环境转移通过亲脂环境的上皮细胞膜进入细胞，最后到达血液。能否将磷脂复合物和壳聚糖微球结合成一个复合载体——磷脂复合物壳聚糖微球（PS-CMs），用于难溶性成分的肺部给药，利用壳聚糖微球的优势增加药物的肺部沉积量，避免肺部清除，利用磷脂复合物促进药物的肺泡吸收，进而增加肺部的药物浓度，提高疗效，成为有待探索的课题。
姜黄素（curcumin，Cur）是从姜科植物姜黄的根茎中提取的有效成分之一，可抑制肺癌A549细胞的增殖、转移并诱导其凋亡[11, 12]，延长恶性转移瘤动物的存活期[13]。为发挥Cur对肺癌的治疗作用，必须将其有效地输送至肺部并吸收。然而，Cur水溶性极低，限制了跨膜转运和吸收，口服生物利用度不足1%，注射给药则因大量增溶辅料的应用存在潜在的安全性问题。因此，有必要研究其治疗肺癌的新给药途径和给药系统。
研究采用喷雾干燥法制备Cur-PS-CMs，对其工艺进行了优化，制备出理论空气动力学径小于5 μm，体外肺部有效沉积率达到59%的Cur-PS-CMs，并对微球的性质、结构进行了表征。研究结果可为进一步探讨PS-CMs吸入给药的体内肺靶向性和吸收机制奠定基础，为研发吸入给药的肺靶向给药系统提供参考。
1 仪器与材料
D101—S型磁力搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；JY92—II DN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；BT—100恒流泵，上海泸西分析仪器厂有限公司；梅特勒-托利多EL2046型电子天平，上海精天电子仪器有限公司；BS—1E恒温振荡培养箱，金壇市精达仪器制造厂；MalvernMastersizer2000型激光粒度仪，英国Malvern公司；ZS90纳米粒度及Zeta电位仪，马尔文公司；UV3100紫外，天美科技有限公司；S3000扫描电子显微镜（SEM），日本Hitachi；Veco Multimode原子力显微镜（AFM），美国Veco公司；200PC热分析仪，德国Netzsch；YC—015A微型实验室有机溶剂喷雾干燥机，上海雅程仪器设备有限公司；MSALXD—3型X射线衍射仪，北京普析通用仪器有限责任公司；两级玻璃撞击器（按《中国药典》2010年版附录X H的规格，自制）；药粉吸入器，泰安凯瑞特高分子有限公司。
Cur（批号120513，质量分数＞95%），杭州绿天生物科技有限公司；大豆磷脂（PC，批号120819，质量分数＞90%），上海太伟药业有限公司；壳聚糖（CS，脱乙酰度93.2%，黏度112 mPa∙s），金湖甲壳制品有限公司；3号空心胶囊，新仓县亚利大胶丸有限公司；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 Cur的测定
参考文献方法[14]，采用分光光度法于420 nm处测定Cur的量。精密称取Cur 7.5 mg，甲醇定容至100 mL，得质量浓度为75 μg/mL的储备液。精密吸取1.0、0.5、0.25、0.1、0.05 mL储备液，用甲醇- 0.1 mol/L盐酸（1∶1）定容至10 mL，得不同质量浓度的Cur对照品溶液，420 nm处测定吸光度（A）值，计算回归方程。结果在0.375～7.5 μg/mL的范围内，Cur在420 nm的A值与质量浓度呈线性关系，回归方程为A＝0.159 9 C＋0.008 7，r＝0.999 9。
2.2 Cur磷脂复合物（Cur-PS）水分散液的制备及性质
参照文献方法[15]制备Cur-PS水分散液并进行表征。将0.5 g Cur、1.0 g大豆磷脂溶于50 mL无水乙醇中，50 ℃水浴搅拌（1 000 r/min）5 h后匀速注入到2 000 mL纯水中，继续搅拌（1 000 r/min）30 min，即得。另取等量Cur，用50mL无水乙醇溶解，匀速注入到2 000mL纯水中，继续搅拌30 min，得Cur水分散液（作对照）。
分别取Cur-PS水分散液和Cur水分散液少许，点于云母片上，自然干燥后用AFM观察形态。将水分散液稀释后直接用纳米粒度及Zeta电位仪测定粒径和Zeta电位。4℃，30 000 r/min离心2 h，取上清液测定游离药物量（WF）；另精密量取适量水分散液，甲醇稀释后测定药物总量（WT）。按下式计算复合率：复合率＝(WT－WF) / WT。
Cur-PS水分散液呈淡黄色乳光，室温放置7 d后外观无明显变化；Cur水分散液放置12 h已有明显的絮状物和沉淀生成。AFM下Cur-PS呈良好的球形，分散均匀，而Cur水分散液可见大量杂乱物质（图 1）。Cur-PS的平均粒径为（42.51±8.05）nm（n＝3），平均Zeta电位为（-13.37±1.94）mV（n＝3），平均复合率为（90.27±2.04）%（n＝3）。
2.3 Cur-PS-CMs的制备
称取一定量的壳聚糖，用200 mL 1%的醋酸水溶液溶解，加入到2 000 mL Cur-PS水分散液中，混合均匀，搅拌条件下（2 000 r/min）以1 mL/min的速率滴加三聚磷酸钠（TPP）溶液，静置过夜，弃上清液后喷雾干燥，条件如下：进口温度为140 ℃，喷雾压力为0.3 MPa，供液速度为3 mL/min，风机频率为20 Hz。工艺条件见表 1。
表 1 Cur-PS-CMs的工艺条件
Table 1 Technology of Cur-PS-CMs
用2000 mL同质量浓度的Cur水分散液代替Cur-PS水分散液，其余条件同F7，同法制备Cur-壳聚糖微球（Cur-CMs）。
2.4 微球的评价
2.4.1 载药量（DL）取微球适量，精密称定质量（W），加混合溶剂（甲醇-0.1mol/L盐酸1∶1）30 mL，探头超声后用0.45 μm微孔滤膜滤过，稀释一定倍数后于420 nm测定A值，计算Cur质量浓度（ρ），按下式计算DL：DL＝ρ×30×稀释倍数 / W。
2.4.2 吸湿性
取一定量微球，精密称定质量（W0），放置于25 ℃、相对湿度为75%的饱和NaCl溶液中，平衡7 d后取出，精密称定微球质量（W1），按下式计算吸湿率：吸湿率＝(W1－W0) /W0。
2.4.3 流动性
将微球粉末通过下孔径为5 mm的玻璃漏斗，从6 cm的高度缓慢、均匀地落入平板上，形成圆锥体。测量圆锥体的高度（h）和基底的直径（d），按下式计算休止角（θ）：tanθ＝2 h/d[16]。
2.4.4 振实密度（ρtap）
精密称取一定质量（W）微球置于封底的1 mL塑料注射器筒中，将注射器从5 cm高度落下，反复振实500次，读取微球体积（V），按下式计算ρtap：ρtap＝W/V[17,18]。
2.4.5 粒径及分布
激光粒度测定仪测定微球的平均体积径（Dv）、d0.1、d0.5和d0.9，按下式计算跨距（span）：span＝(d0.9－d0.1)/d0.5[18]。
2.4.6 理论的空气动力学径
按下式计算理论的空气动力学粒径（Da）：Da＝(ρtap/ρ0)1/2∙Dv，其中ρ0＝1 g/cm3[16,18]。
2.4.7 体外沉积性质
按照《中国药典》2010年版二部附录X H的方法进行。在一级沉积瓶D中，加7 mL无水乙醇作为吸收液，在二级沉积瓶H中加入30 mL无水乙醇作为吸收液。取胶囊1粒（装约20 mg微球，精密称定质量），置吸入装置内，吸入装置用适宜橡胶接口与模拟喉部B呈水平紧密相接，用手指按压装置两侧按钮，将胶囊刺破，开启真空泵，调节流量使其达到60 L/min，10 s后取下吸入器。取出胶囊，收集胶囊内的残留药物，用甲醇-0.1 mol/L盐酸（1∶1）溶解并定容至一定体积，测定Cur的量。用甲醇-0.1 mol/L盐酸（1∶1）分别淋洗吸入装置、模拟喉部、模拟颈部、1级分布瓶和2级分布瓶（包括导管内、外壁及垫片凸出物的表面），洗液分别收集于一定体积的量瓶中，超声并定容至刻度，测定Cur的量。按下式计算有效部位沉积率（FF）和排空率（ED）：FF＝2级分布瓶的药量/胶囊中的总药量，ED＝1－胶囊中剩余的药量/胶囊中的总药量[19]。
不同工艺条件制备的微球的性质考察见表 2，体外沉积结果见表 3。由表 2、3可知，壳聚糖与磷脂的比例对Cur-PS-CMs的性质有很大影响：增加壳聚糖的用量，DL降低，吸湿性增强，流动性变差，平均体积径减小但振实密度增大，使理论空气动力学径先降后升。壳聚糖-磷脂为3∶1时，理论的空气动力学径最小，体外有效沉积率和有效沉积量最大。壳聚糖与TPP的质量比和TPP的浓度对Cur-PS-CMs的影响较小。不同工艺制备的微球排空率无明显差异，几乎都能全部从胶囊中排出。
表 2 Cur-PS-CMs的工艺条件 (x±x, n=3)
Table 2 Characteristic of microspheres prepared with different technologies (x±x, n=3)
表 3 不同工艺条件制备的微球的体外沉积(x±x, n=6)
Table 3 Deposition in vitro of microspheres prepared with different technologies (x±x, n=6)
2.5 微球的结构表征
2.5.1 差示扫描量热法（DSC）分析
分别对Cur、空白磷脂复合物-壳聚糖微球（PS-CMs）、Cur原料药与空白磷脂复合物-壳聚糖微球的机械混合物（Cur＋PS-CMs）、Cur-PS-CMs（F7）和Cur-CMs进行测试。工作条件：升温范围为40～240℃；升温速率为10 ℃/min；参比物为空铝坩埚；气氛为氮气（质量分数为99.99%）。结果见图 2。Cur在171.6 ℃时有明显的吸热峰，PS-CMs在90.9 ℃有1个宽峰；Cur＋PS-CMs图谱中，微球的宽峰移至86.2 ℃，Cur的吸热峰移至167.9 ℃；Cur-CMs分别在89.4 ℃和175.1 ℃显示出微球和Cur的吸热峰，说明Cur的存在状态与原料药相同；Cur-PS-CMs无Cur的吸热峰，微球的宽峰迁移至79.9 ℃，说明，在Cur-PS-CMs中Cur仍以磷脂复合物的形式存在。
2.5.2 X射线衍射（XRD）分析测试样品同“2.5.1”
项。工作条件：Cu靶/石墨单色器，管压为36V，管流为20 mA，步宽为0.01°，扫描速度为2°/min，采样时间为1 s，扫描范围为5°～40°。各样品的XRD图谱见图 3。图 3显示，Cur在8.9°、14.3°、17.3°等处有多个特异性的结晶衍射峰；PS-CMs和Cur- PS-CMs的XRD图谱无明显的晶型峰；Cur与PS-CMs物理混合物的峰形为2种物质的叠加，Cur在8.9°和17.3°的特征峰明显；Cur-CMs也显示出Cur的多个特征衍射峰。可见，在Cur-CMs中，Cur以原始的微晶形式存在；在Cur-PS-CMs中，Cur仍与磷脂复合，未从复合物中解离出来。结果与DSC一致。
2.5.3 扫描电子显微镜（SEM）观察采用SEM观察Cur-PS-CMs（F7）和Cur-CMs的形态。结果可见，Cur-PS-CMs为外形饱满，表面较光滑的球形，大小均匀；Cur-CMs球形差，表面多褶皱、凹陷多（图 4）。
3 讨论
本课题组前期已采用离子凝聚法（滴入法、注入法）和乳化交联法制备Cur-PS-CMs，其粒径分别为（1.11±0.08）mm、（16.19±4.91）μm和（77.48± 19.37）μm[13]，均不符合肺部给药的需求。本研究利用喷雾干燥法将磷脂复合物（PS）包载于壳聚糖微球（CMs）中，最终制备出了可用于吸入给药，将药物递送至肺部的干粉吸入剂。工艺研究发现，壳聚糖与磷脂的质量比是影响微球性质的主要因素。当壳聚糖-磷脂小于1∶1时，壳聚糖太少，无法克服磷脂的半固体性质，因此收集瓶中难以收得干燥的细粉，样品均黏附于干燥塔壁上。当壳聚糖-磷脂为1∶1时，收集瓶壁上有较多细粉出现，但用刷子收集时易聚集黏结成细小颗粒，使得测得的体积径较大，振实体积大而密度小，休止角小而流动性好。随着壳聚糖用量的增加，磷脂复合物壳聚糖微球（PS-CMs）的粉末性增强，体积径减小但振实密度增大，休止角增大，吸湿性增强。当壳聚糖-磷脂为3∶1时，Cur-PS-CMs具有较佳的载药量、吸湿性和理论的空气动力学径。
本研究采用《中国药典》2010年版收载的2级玻璃撞击器对微球进行了初步的体外肺部沉积考察。研究结果显示，壳聚糖与磷脂的比例显著影响有效沉积率，3∶1时的有效沉积率明显高于其他比例，与理论空气动力学径的结果一致。此外，交联剂TPP的浓度也是影响体外沉积的一个重要因素，TPP浓度过高或过低，都会导致有效沉积率降低。实验过程中发现，TPP浓度为3%时，喷雾干燥前的Cur-PS-CMs粒径大，3 h的沉降体积比约为75%；浓度为0.2%时，沉降减慢，12 h的沉降体积比仍高于80%，说明喷干前的2种Cur-PS-CMs粒径差异明显。而粒度分析仪测得的2种Cur-PS-CMs粉末粒径差异却不大。分析原因，可能是由于用0.2%的TPP交联后制得Cur-PS-CMs粉末经过旋风分离器时，只有达到一定大小的粒子才能沉降于收集瓶中，其余粒径很小的粒子则随气流带走，这也与实验中观察到的收集瓶中产品明显减少的现象一致。
对比Cur-CMs和Cur-PS-CMs的性质发现，两者在吸湿性、休止角、振实密度方面无明显差异，Cur-CMs的有效沉积率略小于Cur-PS-CMs。分析其原因，可能与微球的形态有关。扫描电镜观察到Cur-PS-CMs具有良好的球形，表面光滑，而Cur-CMs表面多皱缩凹陷，球形差。良好的球形结构使其更容易随气流分散，因而具有较好的沉积性。
欲达到利用磷脂复合物促进药物吸收的目的，磷脂复合物需从壳聚糖微球中完整的释放出来。DSC和XRD证实，在Cur-PS-CMs中Cur不以原始的结晶形式存在，提示Cur-PS未发生解离，仍保持了复合状态，为复合物的完整释放提供了前提。本实验仅对Cur-PS-CMs的制备和体外沉积进行了研究，Cur-PS-CMs的释药过程和机制，体内肺部沉积和吸收，肺靶向性评价等试验正在进行，将另文发表。
PS-CMs成功构建的关键在于药物-磷脂复合物水分散液的制备。研究过程中，曾用冬凌草甲素做过比较。冬凌草甲素与磷脂在乙醇中可成功复合，但注入水中后复合物即发生解离。这是因为冬凌草甲素的羟基为醇羟基，与磷脂形成的分子间连接并不紧密，遇到较高介电常数的水迅速被隔开。Cur的羟基为酚羟基，与磷脂产生的分子间氢键作用强，遇水后仍能稳定存在。PS-CMs的成功构建有望为具有酚羟基或羧基等基团与磷脂紧密结合的、治疗肺部疾病的难溶性药物提供一种新的药物载体。
